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华中农业大学和山东棉花研究中心联合利用基因技术创制高油酸棉花

华中农业大学和山东棉花研究中心联合利用基因技术创制高油酸棉花

核心提示：近日， 华中农业大学棉花遗传改良团队教授金双侠和山东棉花研究中心遗传育种团队研究员柳展基在国际期刊Plant Biotechnolo宽叶大戟gy Journal合作发表了题为“High oleic acid content, nontransgenic allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L.） generated by knockout of GhFAD2 genes with CRISPR/Cas9 system”的研究论文。

南湖讯 近日， 华中农业大学棉花遗传改良团队教授金双侠和山东棉花研究中心遗传育种团队研究员柳展基在国际期刊Plant Biotechnology Journal合作发表了题为 High oleic acid content, nontransgenic allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L.） generated by knockout of GhFAD2 genes with CRISPR/Cas9 system 的研究论文，介绍了利用CRISPR/Cas9基因技术创制非转基因高油酸棉花新种质的研究结果。

作为单不饱和脂肪酸，油酸具有较高的稳定性，在烹调过程中不易产生反式脂肪酸，被营养学界誉为 安全脂肪酸 。市场上常见的橄榄油和茶籽油，油酸含量均达到70%以上，但价格较为昂贵。高油酸花生来源于自然突变体F435或诱变突变体，油酸含量高达80%。2017年鲁花集团推出高油酸花生油，其价格约为普通花生油的2倍，因其营养价值高、无反式脂肪酸，赢得了消费者的青睐。杜邦先锋公司发布的Plenish高油酸大豆是利用TALEN基因技术获得的，与传统大豆相比，其油酸含量由21%提高至76.5%，亚油酸含量由52.5%降至3.6%，亚麻酸含量也显著降低。这使得Plenish高油酸大豆的脂肪酸组成与橄蒲儿根榄油和茶籽油更加接近，被贴以 用大豆生产橄榄油 的标签，其价格也相应地大幅提高。

棉籽油是我国第五大食用植物油，其油酸含量较低，为14.7%-21.7%；而亚油酸含量较高，为46.7%-58.2%。尽管亚油酸具有降低血液胆固醇、预防动脉粥样硬化的作用，但受其不饱和程度高、性质不稳定、抗氧化性能较弱、易酸败、货架期较短等因素的影响，棉籽油品质仍有待提升。

FAD2基因是油脂合成代谢过程中的关键基因，其编码的 12-脂肪酸脱饱和酶催化油酸（C18:1）进一步脱饱和形成亚油酸（C18:2）。陆地棉为异源四倍体，其基因组中含有8个FAD2同源基因，其中GhFADA/D与拟金发科技开发了智能自动排程系统 (APS)、智能自动配方系统(AFS)、生产进程集中控制系统(MCS)南芥FAD2基因相似性最高，亲缘关系最近。表达分析发现，GhFADA/D瘦身健体主要在种子中表达，尤其在种子发育中后期，表达量更高，预示其在调控棉花种子油分组成中发挥的重要作用。

利用CRISPR/Cas9敲除GhFAD2基因创制非转基因高油酸棉花

该研究以棉花GhFADA/D基因为靶标，分别在其DUF3474和Fatty acid desaturase结构域设计了2个靶点，利用pRGEB32-GhU6.9-NPT II 载体构建了GhFADA/D基因的双靶点载体，通过农杆菌转化棉花品系Jin668吊灯花，获得了35株独立的T0代再生植株。经PCR检测，发现25株（71.43%）含有载体上的NPTII和Cas9基因。利用Sanger测序检测产生的突变，研究发现2个靶点均有突变发生。在25株阳性独立植株中，有19株（有效率76%）在目标位点检测到突变。突变类型以单碱基插入缺失为主，同时也检测到了长片段碱基缺失，为2个sgRNA共同作用的结果。利用PCR和Sanger测序检测T1植株，团队发现所有T0突变均稳定遗传到T1代，T1代中也发现了新的突变。尤为重要的是，在T1代中检测到了4个无载体筛选标记基因的突变单株，被称为非转基因（nontransgenic）突变株。棉花基因组中含有21个GhFAD成员，团队利用Sanger测序详细分析了19个潜在的脱靶位点，结果未检测到脱靶效应；利用GC-MS分析了4个非转基因突变单株种子的脂肪酸组分，与对照Jin668相比，突变体种子中的油酸含量显著升高，亚油酸含量显著降低。本研究还检测了高油酸突变体的主要农艺性状，发现敲除GhFADA/D基因并不影响棉花产量、纤维品质、种子总油分含量和种子萌发率。

金双侠和柳展基为本论文的通讯作者，山东棉花研究中心博士陈义珍为第一作者，山东棉花研究中心傅明川、李浩、王立国和刘任重以及我校张献龙教授也参与了这项工作。该研究受到了国家自然科学基金和山东省农业科学院农业科技创新工程的但更重要的是9个检验项目支持。

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